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　　1、第三章生物敏感元件的固定化,3.1概述 固定化的主要目的是将酶等生物敏感元件限制在一定的空间,但又不妨碍被分析物的自由扩散.与游离相生物材料相比,固相生物材料具有一系列优点: 1)热稳定性提高 2)可重复使用 3)不需要在反应后进行催化物质与反应物质的分离 4)可以根据已知的半衰期(half-life)确定传感器膜的寿命等,3.2 基本方法 夹心法(sandwich)或隔离法(insulation) 包埋法(entrapment) 吸附法 (adsorption) 共价结合法(covalent binding) 交联法(cross linking) 微胶囊法(micro-encapsulati

　　2、on,夹心法,吸附法,共价结合法,交联法,微胶囊法,凝胶包埋法,3.2.1交心法 将生物活性材料封闭在双层滤膜之间,形象地称为夹心法.依生物材料的不同而选择各种孔径的滤膜. 特点: 操作简单 不需要化学处理 固定生物量大 响应速度快 重现性好 适用于微生物和组织膜制作,3.2.2吸附法 经非水溶性载体物理吸附或离子结合作用使生物敏感元件固定,称为吸附法. 吸附的作用力: 氢键 范德华力 离子键 配位键 吸附的牢固程度与溶液的pH、离子强度、温度、溶剂性质和种类以及吸附物的浓度有关,3.2.3凝胶包埋法 将生物分子包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构基质中即为包埋法。 不产生化学修饰 保持生

　　3、物分子活性 膜的孔径和几何形状可任意控制 被包埋物不易渗漏 分子可以在膜中扩散 分子量大的分子在膜中扩散困难,3.2.4共价键合法 使生物活性分子通过共价键与不溶性载体结合而固定的方法。 载体包括无机载体和有机载体。 酶与载体共价键合方式： 与载体直接反应连接 通过同源双功能试剂与载体连接 通过异源双功能试剂与载体连接后再与载体反应连接 选择那种方法,要了解酶的氨基酸残基的反应性(reactivity)、出现频率(frequency of occurrence)和可接近性(accessibility)。 反应性指氨基酸残基的反应活性，即氨基酸残基参与共价反应的 活泼程度。具有反应能力的氨基酸残

　　4、基称为反应性氨基酸。反应性氨基酸常常含有容易对羰基发生亲核攻击的基团，如氨基、巯基和羟基。它们的亲核反应速率又受到基团的亲核性、碱性以及碳阳离子的亲电性等因素的影响,可接近性是指是否能够抵达到蛋白质中的氨基酸残基所在的位置，它与氨基酸残基的梳水性有关。一般而言，疏水性氨基酸多分布在球蛋白分子表面，它们在水环境中能够起到维持蛋白质三维空间结构的作用。 在酶的共价固定中，尤其是要保护活性中心.有两种方法：1)共价反应前用酶的底物或是底物的类似物等将活性中心保护起来。2)利用共价反应的化学选择性和生物特异性异源双功能试剂。 酶与载体之间的共价结合方式，主要有重氮法、肽键法、烷化法等。如图所示,重氮法

　　5、,肽键法,烷化法,共价结合的特点 结合牢固、蛋白质分子不易脱落、载体不易降解、寿命长 操作步骤多、酶活性受影响，所以制备具有高活性的固定化酶比较困难,3.2.5交联法 此法借助双功能试剂(bifunctional agents)使蛋白质结合到惰性载体或蛋白质分子彼此交联成网状结构. 操作简单、结合牢固、在酶源较困难时常常需要加入数倍于酶的惰性蛋白质作为基质。 严格控制pH，交联剂浓度也比较重要,3-5 双功能试剂,戊二醛交联法有一步法和二步法之分。一步交联法是把一定量的酶，抗体和戊二醛同加入溶液中，在一定温度下反应一段时间，然后用透析法或凝胶过滤除去未结合的戊二醛即可得到酶结合物。 在正常情况

　　7、生物活性材料或指示分子。脂质体是由脂质双分子层组成的内部为水相的闭合囊泡. 质肢体的两个重要参数: 俘获容积:一定量脂质做包封的容积,单位是L/mol. 包裹效率:脂双层所包裹的水室所占的比例,脂质体,磷脂双层分子膜,a)脂质体微胶囊膜结构,脂质体微胶囊 包埋指示分子,加入脂溶性物质,脂溶性物质嵌入 脂质体膜,膜遭到破坏,释放指示分子, 给出信号,b)脂质体技术用于生物传感器原理,图3-3 脂质体微胶囊技术固定生物活性材料,溶胶-凝胶法的化学过程是首先将原料分散在溶液中，然后经过水解反应生成活性单体，活性单体进行聚合，开始成为溶胶，进而生成具有一定结构的凝胶，最后经过干燥和热处理得纳米粒子，即

　　9、 polymeric network formed by the assembly of the sol,3.3 LB膜技术 生物传感器的响应速度和响应活性是一对相互影响的因素,固定量增大,响应活性增高,膜厚度增加,响应速度减慢,Langmuir-Blodgeett(LB)膜,LB膜的原理: 许多生物分子在洁净的水表面展开后能形成水不溶性液态单分子膜,小心压缩 表面积使液态膜逐渐过度到成为一个分子厚度的似固态膜,这种膜以技术的发明者 命名,称为LB膜. LB膜实验对液体的纯度、pH和温度有很高的要求 LB膜优点 可以制的很薄的膜，厚度和层数可控， 可获得高密度酶分子膜,LB膜制备: 是由铺膜、

　　10、推膜、挂膜三个基本操作构成。 样品溶解在铺展溶剂中，铺展溶剂须要满足的的条件：对成膜材料溶解性好，易铺展，挥发速度适中，密度相对较低，纯度高和化学惰性。 基片常用的有玻璃、石英、铝蒸镀膜等。基片表面应光滑，并避免油脂类污染,a)表面的单分子膜,b)第一次抽出基片,c)第二次插入基片,d)第二次抽出插片,图 3-6 典型LB膜的沉积过程,4光平版印刷技术(Light lithographic) 光平版印刷术简称光刻(photoetching),利用照相原理与化学腐蚀相结合,在工件表面制取精密、细微和复杂薄层图形,广泛用于印刷电路和集成电路的制造以及印刷制版等过程. 原理 利用光刻胶(photor

　　11、esist)感光后因光化学反应而固化的特点将掩模板(mask)上的图形刻制到被加工表面上.光刻胶是一类对光敏感的高分子溶液,由感光树脂、增感剂和溶剂组成.光刻胶经过光照射后,其理化性质(特别是溶解性和亲和性)发生明显变化,经适当溶剂处理,溶去可溶性部分,得到所需要的图像. 负性胶:光照射后形成不可溶物质 正性胶:光照射后变成可溶物质,掩膜,光聚合,基片,基片,除掉未聚合的 光刻胶及酶膜,图3-7 光致酶膜定位沉积,基片,涂酶层,涂酶层,紫外线照射,灭活酶,活性酶,图3-8 固定化酶的局部灭活法,3.5 固定化生物活性材料的性质 生物分子被固定后,性质会发生变化.酶变化的原因是: 1)载体与环境

　　12、物质之间的静电作用和疏水作用使得酶周围环境中反应物质或氢离子非均匀分布; 2)增加了底物和产物的扩散限制,它们的传质速率也发生变化; 3)酶分子构型发生变化,与之结合的载体对酶活动有一定空间障碍. 3.5.1 固定化酶的稳定性 酶的稳定性描述 1) 在低温和常温条件下长期保存的稳定性 2) 在较高温度条件下的稳定性 3) 固定化酶长期工作的稳定性,含有疏水基团的载体可能减少酶在保存过程中的自然失活 一定条件下,由于静电作用,亲水性载体可能增加酶的稳定性或降低酶的稳定性 如果酶与载体结合后高级结构被稳定下来且酶的活性中心结构变化不大,酶的稳定性会增加. 固定化对酶作用方式和专一性也有影响.载体基

　　15、er. 2003,15,1933,Adv. Mater. 2003,15,1933,3.5.2固定化酶的动力学常数 底物所携带的电荷与载体所带的电荷相反,底物就会在载体周围富集,反之,底物浓度就会在固定化酶的微环境中下降. 底物扩散也是影响酶促反应的因素之一,分两个方面: 1)固相载体对底物扩散的阻碍作用，成为外部扩散限制(external diffusion limitation) 2)底物在载体内部扩散时因载体孔径大小不同遇到的阻碍作用，成为内部扩散限制(internal diffusion limitation) 当酶促反应速率远低于底物扩散速率并且底物浓度足够大时，酶促反应呈一级动力学

　　16、，实验所测得的动力学参数为真实值。如果在酶附近的底物浓度很低，酶促反应速率将受控于底物扩散的限制。需要实验数据求得固定化酶的真实动力学常数,第四章 电化学生物传感器之一：经典酶电极 4 .1概述,4.2 基础电极 4.2.1 离子选择电极 离子选择电极(Ion selective electrode)是对特定离子产生选择性响应的一类电化学传感器,其主要结构如图,引出导线,电极帽,塑料内管,电极壳,内参比电极,内充液,敏感膜,膜电位包括膜内的扩散电位和相界面电位,其值通过完整的电化学电池的电动势的测量来推算,电池表示如下,电极A 溶液1 膜 溶液2 电极B,电极电位,电极电位,膜电位,如果溶液1

　　17、中含有被选择的离子,其活度应与膜电位在一定的范围内线性相关,遵循 Nernst方程: E=E0(RT/zF)ln 或E=E0(2.303RT/zF)ln E为离子选择性电极的电位； E0为电位常数项；R为气体常数；F为法拉第常数；为要测量离子的活度；z为离子的价数；T为绝对温度；2.303RT/zF为Nernst斜率，是温度的函数,表 4-1 离子选择性电极举例,膜的种类很多,包括无机膜(如玻璃膜,单晶膜,陶瓷膜等)和有机膜(如 微孔塑料膜,透气膜,离子交换膜等),膜的性质决定了电极的性质,最常用于生物电极制作的是气敏电极。气敏电极一般由复合离子选择电极，气 透膜(gaspermeable m

　　18、embrane)和内充液(inner buffer)三部分组成. 复合电极由指示电极和参比电极构成,指示电极多用pH玻璃电极,参比电极常用 Ag/AgCl电极.前者是迄今性能最可靠的离子选择性电极,后者是重现性和稳定性最好 的参比电极之一,气透膜有两类: 一类是非均相微孔膜,一类是均相塑料薄膜。膜材料为憎水性,溶液及离子均不能透过,气体可以透过. 相应气体在某一膜内中的扩散系数D及气体在膜与水相中分配数K的乘积DK值是衡量膜选择性的重要参数. 内充液是被测气体参与界面反应的介质,一般为电解质水溶液.含有两种基本成分: 界面化学反应中需要维持活度基本恒定的离子 对参比电极可逆并能使其电位恒定的离

　　20、个目的: 1) 在阳极和阴极间施加一定极化电压(0.6-0.7 V) 2) 测定通过阴极的电流 阴极在基质溶液中带有电子.由于在电极上施加电压,当氧扩散至阴极时能被还原成过氧化氢. O2 + 2H+ + 2e H2O2 并以阴极铂丝为中心形成扩散层,这种扩散电流与试样溶液中氧分压成线性关系,电极上氧消耗的速率超出氧在电极上反应的限制因素,此时可用Fick法则表示: dO2/dt= Ddc/dx dO2/dt为单位时间氧穿过扩散层的量;D为氧在液相中的扩散系数; dc/dx为扩散层的浓度梯度. 由于到达电极的氧将产生电流: i = k D dc/dx dc/dx显然取决于反应液中的氧浓度,所以:

　　21、 i = k D O2 即电极电流直接与基质溶液中的氧浓度成正比,二 电压与电流的关系,三 电流型电极性能 现在的商品氧电极都是隔膜型(clark型),这种氧电极通过一层气透膜(聚乙烯膜或teflon膜)将电极与外溶液隔开,使氧能透过膜发生电极反应,而其他溶质分子却被阻止在膜外。电极腔内盛半饱和的KCl溶液以维持参比电极的稳定性。 氧电极的输出电流为nA级。teflon隔膜为1m厚时，达到90%响应的时间约为510s,4.3生物电极测定方法,在一个持续搅拌的反应池中进行,在一个流通反应池中进行,流通法 (flow through,流通法:样品被不断的输送到电极上,至改通入缓冲液 稳态法:反应时

　　22、间长,图 4-3 生物电极的测定方法 a流动注射法 b流通法 c稳态法,离子选择电极,流动注射分析系统 (flow injection analysisi,4.4 酶电极 酶电极由固定化酶和基础电极组成.固定化酶膜与基础电极紧密结合称为密接型;将固定化酶充填在反应器内,连同基础电极组成流动分析系统称为分离型, 密接型应用比较广泛. 酶电极的设计主要参考酶促反应过程产生或消耗的电极活性物质(electroactive substance),如果一个耗氧过程,就可以使用O2电极或H2O2电极作为基础器件;若酶反应为产酸过程,则可使用pH电极,一 血糖测定 血糖葡萄糖测定是糖尿病和许多代谢紊乱的诊断

　　25、液中的浓度和在体液中的浓度一般分别低于2.7 mmol/L和1.22.1 mmol/L. 下列几种酶适合于用电流法进行乳酸测定:乳酸脱氢酶(LDH),细胞色素b2(Cyt b2),乳酸氧化酶(LOD, EC1. 1. 3. 2)和乳酸单加氧酶(LMO), 它们的催化过程如图,LDH,Cyt b2,LOD,LMO,三 尿素测定 血液中尿素浓度是评价肾功能的指标,正常值为3.68.9 mmol/L. 检测反应,基础电极: 氨敏电极, CO2电极或是pH 电极,四 尿酸测定 尿酸是核酸中嘌呤分解代谢的终产物,正常值为27 mg/dl,尿酸测定对诊断痛风十分有帮助. 基础电极: 氧电极 五 肌酸和肌酐

　　26、测定 肌酐清除实验是测定肾小球过滤的最灵敏试验之一,正常值为0.91.5mg/dl. 基础电极:氨电极,六 谷氨酰氨测定 谷氨酰氨正常值为614 mg/dl, 肝硬化患者脑脊液中谷氨酰氨含量明显增高,肝昏迷是可达 50 mg/dl 以上. 基础电极:氨电极 七 谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)测定 血清转氨酶活力对诊断病毒性肝炎和中毒性肝炎及了解肝细胞损害电极有重要参考价值,正常值为025 单位. GPT 催化反应: L-丙氨酸 + -酮戊二酸 丙酮酸 + L- 谷氨酸,4.4.2 发酵和食品成分分析 一 氨基酸类 L-氨基酸能被L-氨基酸氧化酶(L-AAO)氧化,生成氨和过氧化氢,所以测定氧,氨

　　27、或过氧化氢都可能定量测定氨基酸.目前至少有8种氨基酸能用酶电极来测定. 二 酒精测定,辅酶参与,增加难度,性能要优越,三 单胺测定 肉食品腐败过程中会产生各种胺类,胺类的测定能反映肉食的 新鲜程度.单胺氧化酶(MAO)能催化各种单胺化合物氧化脱氨. 基础电极: 氧电极,四 -硫代葡萄糖苷测定 脱脂油菜子含40%蛋白质,是牲畜的常用饲料,然而与蛋白质共存的-硫代葡萄糖苷对牲畜有毒害作用. 基础电极: 葡萄糖氧化酶电极 五 另外,还有维生素C,淀粉,纤维素,过氧化氢,果糖,抗生素测定 4.4.3 环境毒物测定 基于乙酰胆碱水解的电流型酶电极检测有机磷农药,原理如下,有机磷农药会使乙酰胆碱脂酶失活,

　　28、过氧化氢产生于是减少,电流减低,可用于测定农药,4.4.4 其他酶电极 4.4.5 有机相酶电极 许多酶可以在有机溶剂中进行催化反应,利于难溶物质的测定. 酶的固定化方法会影响有机相酶电极的性能. 共价键合和共价交联方法不适合有机相酶电极的制作,因为有机溶剂可能会攻击共价键.由于酶在有机溶剂中不溶解,可以采用简单的吸附法.碳纤维,多孔玻璃珠,石墨片等都是良好的吸附载体.也可以采用聚合物包埋法. 有机溶剂对酶活力有明显影响. 疏水性用lgP值表示,P是溶剂在标准两相辛醇-水系统中的分配系数. lgP4的溶剂具有强疏水性,不会与酶分子表面的水分子层发生反应 lgP2的溶剂具有强亲水性,可能夺走酶分

　　29、子周围的水分子,从而影响酶的活性. lgP在2-4之间的溶剂能够移走一部分酶促反应所需要的水,其影响难以预测. 传感器的响应灵敏度与溶液的lgP值成正相关,与极性(介电常数值)成反相关.可以用酶电极的响应信号来指示酶在不同有机溶剂中的活性,有机相中混入了少量水分,可以使酶电极的信号获得放大.利用这一原理,建立了测定食品中水分含量的方法.可以获得与水分含量相关的校正曲线. 有机介质成分对有机相酶电极的性能有明显的影响.原因:1) 被分析物在有机介质中的溶解度.溶解度的不同对电极性能有不同的影响.2)一些溶剂本身是蛋白质变性剂. 4.5 多功能酶电极 为了满足人们在同一时间想了解多种物质的存在状态

　　30、,多功能传感器(multifunctional enzyme electrode)应运而生. 分为两种类型,共同特征是不止一 种分子识别元件参 与了传感过程,多功能传感器中有多种分子识别元件参与了传感过程，但这一点要与杂合生物传感器区别开来，杂合生物传感器通过顺序催化反应，由最后一种分子识别元件产生电极活性物质。 另外要注意与BOD传感器的区别, BOD是一种典型的综合性指标,其测定也是由微生物细胞内多种酶协同完成的,但最终反映出来的是一种细胞的外源呼吸速率,也不属于多功能范围,采用一种基础器件,其上层积各种分子识别元件,样品经层析使 分析物逐一分开,顺序进入检测池,依次被响应. 效率较高,4

　　31、.5.1 鲜度传感器 大量研究表明,生物体死后体内高能化合物ATP迅速按顺序水解,HxR(次黄苷,Hx(次黄嘌呤,尿酸,因此, 迅速测出这些化合物浓度,经过综合判断,就能推算出鱼肉鲜度,4.5.2 滋味传感器 Hayashi等建立了一中传感系统,能够通过检测色、香、味来”品尝”汤的味道, 用于精炖肉汤生产过程的质量控制. 通过检测CE(色),Bx值(糖度),G值(香),IMP, L-谷氨酸,-D-葡萄糖和乳酸的含 量,将侧得的数值进行多元回归,最终的滋味评估将由大量数据来确定,4.5.3 葡萄糖与双糖和多糖同步测定,用上图装置来同时测定葡萄糖和糖的总量.电极I为GOD电极,其响应值仅与样品中葡

　　32、萄糖 浓度有关,电极II为顺序酶电极,用来测定糖的总量.实验结果显示,双糖的存在对葡萄糖测定 没有影响.而双糖测定线性范围的上限受到葡萄糖浓度的影响,4.6 微型酶电极(micro enzyme electrode) 直径在1m以下的电极称为微型酶电极,Ag/AgCl 辅助/拟参比电极,聚乙烯导管,Pt丝和微球工作电极,环氧胶,复合酶膜,CA-BSA-PBQ-GOD,Pu层,CA:乙酸纤维素 BSA:牛血清白蛋白 PBQ:对苯醌 Pu:聚氨基甲酸乙酯,复合层酶膜的功能之一是改善电极 的电化学选择性,Pt电极对抗坏 血酸和H2O2的响应值很接近.随着 不同膜的覆盖和层数的增加,比值不 断下降,由此区别并排除中性分子 (H2O2)和阴离子(抗坏血酸)的干扰,4.7 结束语 大多数生物传感器所用的酶都是先通过酶电极来实现的. 经典酶电极始终在传感器的发展中占据重要位置. 氧化还原酶类十分适合与电化学测量,其他酶类所催化的反应也能够很容易的实现与电化学的装置.因此,酶电极的种类将会越来越多. 由于酶的多样性,许多生物化学测定可以通过设计各种复合酶电极或顺序酶电极来完成. 尽管多功能酶电极所提供的成功例子比较有限,但是多参数同步测定肯定是生物传感器的一个发展趋势. 微型酶电极显然具有极大的吸引力,它们将在细胞活体测定中起到难以取代的作用,并可能用于身体的微创测定

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